scholarly journals Ganglioside GD2 Enhances the Malignant Phenotypes of Melanoma Cells by Cooperating with Integrins

2021 ◽  
Vol 23 (1) ◽  
pp. 423
Author(s):  
Farhana Yesmin ◽  
Robiul H. Bhuiyan ◽  
Yuhsuke Ohmi ◽  
Satoko Yamamoto ◽  
Kei Kaneko ◽  
...  
Keyword(s):  
Cell Adhesion ◽  
Cell Membrane ◽  
Growth Factor Receptor ◽  
Melanoma Cells ◽  
Membrane Lipid ◽  
Proximity Ligation Assay ◽  
Integrin Β1 ◽  
Ganglioside Gd2 ◽  
Proximity Ligation ◽  
Epithelial Growth Factor

Gangliosides have been considered to modulate cell signals in the microdomain of the cell membrane, lipid/rafts, or glycolipid-enriched microdomain/rafts (GEM/rafts). In particular, cancer-associated gangliosides were reported to enhance the malignant properties of cancer cells. In fact, GD2-positive (GD2+) cells showed increased proliferation, invasion, and adhesion, compared with GD2-negative (GD2−) cells. However, the precise mechanisms by which gangliosides regulate cell signaling in GEM/rafts are not well understood. In order to analyze the roles of ganglioside GD2 in the malignant properties of melanoma cells, we searched for GD2-associating molecules on the cell membrane using the enzyme-mediated activation of radical sources combined with mass spectrometry, and integrin β1 was identified as a representative GD2-associating molecule. Then, we showed the physical association of GD2 and integrin β1 by immunoprecipitation/immunoblotting. Close localization was also shown by immuno-cytostaining and the proximity ligation assay. During cell adhesion, GD2+ cells showed multiple phospho-tyrosine bands, i.e., the epithelial growth factor receptor and focal adhesion kinase. The knockdown of integrin β1 revealed that the increased malignant phenotypes in GD2+ cells were clearly cancelled. Furthermore, the phosphor-tyrosine bands detected during the adhesion of GD2+ cells almost completely disappeared after the knockdown of integrin β1. Finally, immunoblotting to examine the intracellular distribution of integrins during cell adhesion revealed that large amounts of integrin β1 were localized in GEM/raft fractions in GD2+ cells before and just after cell adhesion, with the majority being localized in the non-raft fractions in GD2− cells. All these results suggest that GD2 and integrin β1 cooperate in GEM/rafts, leading to enhanced malignant phenotypes of melanomas.

scholarly journals UV Exposure alters the membrane lipid composition and cell membrane fluidity of intact cultured B-16 melanoma cells.

1988 ◽  
Vol 35 (4) ◽  
pp. 159-169 ◽  
Author(s):  
TOSHIHIKO SAKANASHI ◽  
MASAYASU SUGIYAMA ◽  
TOMOMASA SUEMATSU ◽  
TETSURO NAKAGAWA ◽  
TOSHIHIRO HIDAKA ◽  
...  
Keyword(s):  
Cell Membrane ◽  
Membrane Fluidity ◽  
Lipid Composition ◽  
Melanoma Cells ◽  
Membrane Lipid ◽  
Uv Exposure ◽  
Membrane Lipid Composition ◽  
Cell Membrane Fluidity

scholarly journals Μελέτη της επίδρασης της οικογένειας του EGFR στον καρκίνο του μαστού

2019 ◽  
Author(s):  
Ηλιάννα Ζώη
Keyword(s):  
Western Blot ◽  
Growth Factor Receptor ◽  
Nuclear Factor Κb ◽  
Proximity Ligation Assay ◽  
Proximity Ligation ◽  
Scratch Wound ◽  
Her 2 ◽  
Epidermal Growth ◽  
Scratch Wound Healing Assay

Εισαγωγή: Ο human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) υπερεκφράζεται στο 20-30% των περιπτώσεων καρκίνου του μαστού (ΚΜ) και σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Σηματοδοτικά μονοπάτια καθοδικά του υποδοχέα receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) παίζουν κεντρικό ρόλο στον ΚΜ. Το σηματοδοτικό μονοπάτι RANKL/RANK εμπλέκεται στον HER-2(+) ΚΜ. Ο μοριακός μηχανισμός της συμμετοχής του στην καρκινογένεση παραμένει αδιερεύνητος. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της εμπλοκής του RANK υποδοχέα, και του σηματοδοτικού μονοπατιού του NF-κB στην ογκογένεση των HER-2(+) καρκινωμάτων μαστού (ΚΜ). Επιπλέον στόχος είναι η αποσαφήνιση του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης της RANKL/RANK σηματοδότησης από μέλη της οικογένειας EGFR μέσω πιθανής φυσικής αλληλεπίδρασης, επηρεάζοντας βασικές κυτταρικές ιδιότητες. Τελικός στόχο της μελέτης αποτελεί η in vitro αξιολόγηση της συνδυαστικής αναστολής των RANK και EGFR υποδοχέων στην εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων γεγονός που συμβάλει σε νέες πιθανές θεραπευτικές προτάσεις. Υλικά και Μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ΚΜ, SKBR3, BT474, MCF7, MDA-MB-453. Μελετήθηκε η έκφραση των RANK και RANKL, μέσω RT-PCR, Western-Blot και τεχνικές ανοσοφθορισμού. Η αλληλεπίδραση του RANK με τον HER-2 ανιχνεύθηκε μέσω της μεθόδου Proximity Ligation Assay (PLA), η οποία επιτρέπει την οπτικοποίηση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Η ενεργοποίηση του NF-κB μονοπατιού μελετήθηκε μέσω Western-Blot. Χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς trastuzumab (T), pertuzumab (P), denosumab (D) των δύο μελετώμενων μονοπατιών. Εφαρμόστηκαν λειτουργικές δοκιμασίες μετανάστευσης, απόπτωσης και πολλαπλασιασμού. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μελετήθηκε εκτιμώντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων με τη δοκιμασία ΧTT και του clonogenic assay, το μεταναστευτικό δυναμικό με τη βιοδοκιμή προσομοίωσης τραύματος δι’ αμυχής (Scratch-Wound Healing Assay), ενώ η απόπτωση μέσω FACS έπειτα από χρώση των κυττάρων με ανεξίνη V. Αποτελέσματα: Η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχεα RANK και του συνδέτη του RANKL εντοπίστηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ο υποδοχέας RANK βρέθηκε ότι διμερίζεται με τα μέλη της οικογένειας EGFR. Ο αριθμός των διμερών RANK/ HER-2 ανά κύτταρο φαίνεται να εξαρτάται από την έκφραση του HER-2 (SKBR3:5.4,BT474:8.2,MCF7:0.7,MDA-MB-453:0.3). Τα διμερή RANK/ HER-2 μειώνονται παρουσία των αναστολέων Denosumab (D), Trastuzumab (T) και Pertuzumab (P), ενώ αυξάνονται παρουσία του RANKL (R) στα κύτταρα SKBR3 (m:5.4, D:1.2, T:1.9, DT:0.6, TP:1, DTP:0.4, R:11.8) και BT474 (m:8.2, D:3.1, T:4.3, DT:0.7, TP:3.4, DTP:3.2, R:11.6). Η συνδυαστική επώαση των κυττάρων SKBR3 με τους αναστολείς μειώνει περαιτέρω την ενεργοποίηση του μονοπατιού NF-κB σε σχέση με τη μονή στόχευση. Η αναστολή των RANKL και HER-2 στη κυτταρική σειρά SKBR3 έχει ως αποτέλεσμα τον μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αυξημένη απόπτωση και χαμηλότερο μεταναστευτικό δυναμικό συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου (m) ενώ αντίθετες τιμές παρατηρήθηκαν παρουσία RANKL. Η συνδυαστική επώαση των κυττάρων SKBR3 με D, T και P πλεονεκτεί έναντι της μονής στόχευσης στις λειτουργικές δοκιμασίες. Το denosumab κατέστειλε την NF-κΒ σηματοδότηση και ελάττωσε το ρυθμό πολλαπλασιασμού στα καρκινικά κύτταρα MDA-MB-453. Η κυτταρική σειρά MCF7 δεν ανταποκρίθηκε στους αναστολείς. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν μια νέα φυσική και μοριακή συσχέτιση μεταξύ των HER-2 και RANK μονοπατιών, η οποία επηρεάζει την εξέλιξη των HER-2(+) ΚΜ. Επιπλέον, παρουσιάζονται ενδείξεις που καθιστούν τη συνδυαστική στόχευση των RANKL, HER-2 ως ωφέλιμη θεραπευτική στρατηγική, η οποία θα πρέπει να ελεγχθεί περαιτέρω σε συγκεκριμένους ασθενείς με ΚΜ.

scholarly journals RAB37 Promotes Adipogenic Differentiation of hADSCs via the TIMP1/CD63/Integrin Signaling Pathway

2021 ◽  
Vol 2021 ◽  
pp. 1-13
Author(s):  
Haili Huang ◽  
Anran Li ◽  
Jin Li ◽  
Dan Sun ◽  
Ling Liang ◽  
...  
Keyword(s):  
Signaling Pathway ◽  
Early Stage ◽  
Adipogenic Differentiation ◽  
Critical Role ◽  
Proximity Ligation Assay ◽  
Integrin Β1 ◽  
Protein Levels ◽  
Proximity Ligation ◽  
Matrix Metalloproteinase 1

The adipogenic differentiation ability of human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADSCs) is critical for the construction of tissue engineering adipose, which shows promising applications in plastic surgery and regenerative medicine. RAB37 is a member of the small RabGTPase family and plays a critical role in vesicle trafficking. However, the role of RAB37 in adipogenic differentiation of hADSCs remains unclear. Here, we report that both the mRNA and protein levels of RAB37 fluctuated during adipogenic differentiation. Upregulation of RAB37 was observed at the early stage of adipogenic differentiation, which was accompanied by increased expression of transcription factors PPARγ2 and C/EBPα, and lipoprotein lipase (LPL). Overexpression of RAB37 promoted adipogenesis of hADSCs, as revealed by Oil Red O staining and increased expression of PPARγ2, C/EBPα, and LPL. Several upregulated cytokines related to RAB37-mediated adipogenic differentiation were identified using a cytokine array, including tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP1). ELISA confirmed that upregulation of RAB37 increased the secretion of TIMP1 by hADSCs. Proximity ligation assay showed that RAB37 interacts with TIMP1 directly. Knockdown of TIMP1 compromised RAB37-mediated adipogenic differentiation. In addition, TIMP1 binds membrane receptor CD63 and integrin β1. RAB37 promotes Tyr397 phosphorylation of FAK, an important protein kinase of the integrin β1 signaling. Moreover, both knockdown of CD63 and inhibitor of FAK impeded RAB37-mediated adipogenic differentiation. In conclusion, RAB37 positively regulates adipogenic differentiation of hADSCs via the TIMP1/CD63/integrin β1 signaling pathway.

Proximity Ligation Assay (PLA) Protocol Using Duolink® for T Cells

BIO-PROTOCOL ◽  
2016 ◽  
Vol 6 (10) ◽  
Author(s):  
Valentin Derangère ◽  
Mélanie Bruchard ◽  
Frédérique Végran ◽  
François Ghiringhelli
Keyword(s):  
T Cells ◽  
Proximity Ligation Assay ◽  
Proximity Ligation
Sign in / Sign up

Export Citation Format

Share Document