Xây dựng kỹ thuật Real-time COLD-PCR có độ nhạy cao để phát hiện đột biến RTA194T kháng thuốc Tenofovir điều trị viêm gan B

Đột biến rtA194T trên vùng gen mã hóa cho enzym RTase của HBV được chứng minh có liên quan đến tình trạng kháng thuốc Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) trong điều trị viêm gan B mạn tính. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng thành công kỹ thuật real-time COLD-PCR sử dụng TaqMan LNA probe có với tỷ lệ 0,1% đột biến/thể dại (mt/wt) để phát hiện sớm đột biến rtA194T ở bệnh nhân viêm gan B điều trị TDF. Kỹ thuật sau đó đã được thử nghiệm để phát hiện đột biến rtA194T trên 75 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mạn tính đã và đang điều trị với TDF, và kết quả là chúng tôi không ghi nhận trường hợp bệnh nhân nào mang đột biến rtA194T. Kết luận lại, kỹ thuật real-time COLD-PCR sử dụng TaqMan LNA probe có độ nhạy cao (0,1% mt/wt) với thời gian thực hiện nhanh trong vòng 3 giờ có tiềm năng ứng dụng trong việc sàng lọc sớm đột biến rtA194T liên quan tới kháng thuốc TDF để tư vấn và theo dõi hiệu quả việc điều trị thuốc TDF cho bệnh nhân viêm gan B trong tương lai.

Simultaneous monitoring of transcription and translation in mammalian cell-free expression in bulk and in cell-sized droplets

Transcription and translation are two critical processes during eukaryotic gene expression that regulate cellular activities. The development of mammalian cell-free expression (CFE) systems provides a platform for studying these two critical processes in vitro for bottom-up synthetic biology applications such as construction of an artificial cell. Moreover, real-time monitoring of the dynamics of synthesized mRNA and protein is key to characterize and optimize gene circuits before implementing in living cells or in artificial cells. However, there are few tools for measurement of mRNA and protein dynamics in mammalian CFE systems. Here, we developed a locked nucleic acid (LNA) probe for monitoring transcription in a HeLa-based CFE system in real-time. By using this LNA probe in conjunction with a fluorescent reporter protein, we were able to simultaneously monitor mRNA and protein dynamics in bulk reactions and cell-sized single-emulsion droplets. We found rapid production of mRNA transcripts that decreased over time as protein production ensued in bulk reactions. Our results also showed that transcription in cell-sized droplets has different dynamics compared to the transcription in bulk reactions. The use of this LNA probe in conjunction with fluorescent proteins in HeLa-based mammalian CFE system provides a versatile in vitro platform for studying mRNA dynamics for bottom-up synthetic biology applications.

Amplification-free in situ KRAS point mutation detection at 60 copies per mL in urine in a background of 1000-fold wild type

We have examined thein situdetection of a single-nucleotideKRASmutation in urine using a (Pb(Mg1/3Nb2/3)O3)0.65(PbTiO3)0.35(PMN-PT) piezoelectric plate sensor (PEPS) coated with a 17-nucleotide (nt) locked nucleic acid (LNA) probe DNA complementary to theKRASmutation.