Relationship between Virus Replication and Apoptosis Events in IgM + Cells from Chicken Spleen and Bursa of Fabricius Infected with Malaysia Strain of Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus

Background: Infection of IBDV was reported to be endemic in worldwide including Malaysia and can be spread orally thru polluted fodder and water source, thus causing economic losses especially in commercial poultry industry. The infection resulted in depletion of B lymphocytes and subsequently destruction of the bursa which leaded to immunosuppression of the bird and it was postulated that the depletion of cells in the bursa was due to induction of apoptosis. In the current study, the infection of Malaysia isolated very virulent IBDV UPM0081 on IgM bearing B lymphocytes (IgM+ cells) from chicken spleen and bursa was compared.Materials, Methods & Results: A total of sixty eggs were obtained and raised until the age of 3 weeks old. The birds were divided into two groups (n = 30), which one of them served as control while IBDV strain UPM0081 was used to infect another group of birds at the concentration of 103 ELD50. The birds were observed and sacrificed at day 2, 4 and 5 post infections. Spleen and bursa of Fabricius were harvested and subjected to IgM+ cell enrichment using microbeads. The cell viability of enriched cells was assayed using MTT and cell cycle was analyzed using propidium iodide. Annexin V FITC and acridine orange/propidium iodide double stain assays were used to determine the event of apoptosis in the enriched IgM+ cells. Also, the IBDV viral load was also quantified by using real time PCR to evaluate the relationship between virus replication and apoptosis events in the infected chickens. Current results showed that the apoptotic events were observed to be significantly higher in IgM+ cells isolated from chicken bursa as compared to the cells isolated from spleen. The bursal B lymphocytes cell viability was observed to be decreasing following the infection of very virulent IBDV. The cells were then investigated of their apoptotic rate and data showed that increasing apoptotic cells (early and late apoptosis) were observed in AO/PI double stain as well as increment of SubG0/G1 population in the cell cycle analysis and also increment of Annexin V FITC bound cells in the apoptosis study. As for B lymphocytes from chicken spleen, the magnitude of damage caused by very virulent IBDV was not as severe as what being observed in the chicken bursa, with the cell viability drastically decreased on day 4 following IBDV infection.Discussion: IBDV caused severe destruction in bursa of Fabricius compared to spleen, in which cell death events in the former was reported to be directly caused by the virus. Apoptotic event in chicken spleen following IBDV infection was observed to be caused by oxidative stress. Thus, viral replication played a role in inducing bursal IgM+ cells death while such phenomenon was not observed in spleen isolated IgM+ cells. In summary, the cell death events of IgM+ cells in chicken spleen and bursa of Fabricius may be accounted by different factors upon infection with Malaysia strain of IBDV UPM0081. It is obvious that IgM+ cells from chicken bursa suffered from apoptotic cell death in an increasing manner considerably with time of infection and RNA load detected in the cells, which supported by previous literature that IBDV induces host cells apoptosis, with both VP2 and VP5 playing a role in binding and apoptosis. Meanwhile, the cell death events of B lymphocytes in chicken spleen was observed to be more relevant to other factors such as the oxidative stress or proinflammatory cytokines that caused by the virus infection rather than the viral RNA load.

Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Umbi Bawang Dayak (Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.) Secara Oral pada Mencit BALB/C Terhadap Pencegahan Penurunan Jumlah Sel yang Terekspresi IFN-ɤ dan Peningkatan Jumlah Sel yang Terekspresi CD 14

ABSTRAKEkstrak Etanol Bawang Dayak mengandung senyawa-senyawa turunan Naphtoquinones dan turunannya, Naphtoquinones tersebut merupakan senyawa antimikroba, antifungal, antiviral, antiparasitik, memiliki bioaktivitas anti kanker dan anti oksidan. Kandungan fitokimia pada bawang dayak diyakini sebagai metabolik sekunder. Unsur Fitokimia pada bawang dayak yaitu Tanin sebagai antioksidan, Alkaloid sifat basanya memepermudah dekomposisi sinar UV, Glikosida ,Steroid, Flavonoid berkaitan dengan inakativasi karsinogen, anti proliferasi, penghambatan siklus sel, induksi apoptosis,differensiasi,inhibisi,angiogenesis serta mencegah resistensi multi therapi.Imunotherapi Supresi suatu metode terapi yang berfungsi menekan sistem imun. Contoh bahan obat yang berkaitan dalam metode tersebut adalah golongan Glukokortikoid. Kortikosteroid merupakan obat yang mudah ditemukan serta luas penggunaanya di klinik. Begitu luasnya penggunaan kortikosteroid ini bahkan banyak yang digunakan tidak sesuai dengan indikasi maupun dosis dan lama pemberian dapat menimbulkan efek samping yang tidak diinginkan. Prednisolon mempunyai efek glukokortikoid yang dominan dan merupakan kortikosteroid oral yang paling sering digunakan dalam terapi supresi penyakit jangka panjang. Berdasarkan hal tersebut perlu dipikirkan obat dari bahan alam yang mencegah penurunan imun sistem akibat pemberian kortikosteroid. Pada pemakaian kortikosteroid jangka panjang, jika imun sistem tidak dipertahankan dan penurunan imun sistem akan terjadi infeksi dan kematian. Aktivasi makrofag dapat dilakukan oleh mediator yang dilepaskan oleh limfosit yang dirangsang antigen pada permukaannya. Aktivasi makrofag dapat pula oleh induksi komponen komplemen,interferon (IFN) atau endotoksin (LPS) produk bakteri. Aktivasi makrofag memerlukan rangsangan non spesifik. Makrofag sebagai fagosit profesional menghancurkan patogen melalui beberapa reseptor merangsang produksi substansi mikrobial melalui CD14.Tujuan penelitian ini ingin membuktikan efek pemeberian ekstrak EEUBD terhadap pencegahan penurunan jumlah sel yang terekspresi IFN-ɤ dan peningkatan jumlah sel yang terekspresi CD 14.Hewan coba yang digunakan adalah mencit jantan strain BALB/C umur 12 minggu,BB 25-30 gram. Dilakukan random alokasi 30 ekor mencit, yang dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu kelompok 1 sampai kelompok 5 masing–masing sebanyak 6 ekor mencit. Mencit pada kelompok 1 atau kontrol tidak diberikan Metilprednisolon dan EEUBD. Mencit kelompok 2 diberikan Metilprednisolon. Mencit pada kelompok 3-5 diberikan Prednisolon dan EEUBD dengan konsentrasi 50 mg/kgBB, 100 mg/kgBB dan 200 mg/kgBB.Mencit pada kelompok 1 diberi sonde larutan CMC Na+ 0,5 % sebanyak 0,1ml/10gBB1x/hari (volume lambung mencit sekitar 0,5 - 1 cc) setiap hari selama 14 hari (waktu yang diperlukan untuk terbentuknya respon imun ialah 10 hari, maka peneliti menetapkan 14 hari untuk mengurangi risiko kegagalan). Mencit pada kelompok 2 diberi sonde larutan metilprednisolon oral 0,08 mg/30 grBB mencit/hari. Mencit pada kelompok 3 diberikan sonde larutan metilprednisolon dan ekstrak umbi bawang dayak konsentrasi 50 mg/kgBB setiap hari selama 14 hari. Mencit pada kelompok 4 diberikan sonde larutan metilprednisolon dan ekstrak umbi bawang dayak konsentrasi 100 mg/kgBB setiap hari selama 14 hari. Mencit pada kelompok 5 diberikan sonde larutan metilprednisolon dan ekstrak umbi bawang dayak konsentrasi 200 mg/kgBB setiap hari selama 14 hari.Hasil yang didapat adalah Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ada pengaruh pemberian ekstrak etanol umbi bawang dayak (Eleutherine bulbosa (mill.) urb.) secara oral pada mencit BALB/C terhadap pencegahan penurunan jumlah sel yang terekspresi IFN-ɤ secara bermakna dan peningkatan jumlah sel yang terekspresi CD 14 yang kurang bermakna.Jumlah sel pengekspresi CD 14 pada kelompok pemeberian dosis 200 mg/kgBB EEUBD dan Metil Prednisolon ( P3) lebih tinggi secara bermakna dibandingkan dengan kelompok tanpa pemberian ekstrak EEUBD (K) dan kelompok model (Metil prednisolon), dimana nilai rerata dan simpangan baku untuk kelompok P3 (4,9000 ± 1,54406). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ada pengaruh pemberian EEUBD pada mencit BALB/C terhadap peningkatan jumlah sel pengekspresi CD 14 secara bermakna.Analisis hubungan antara jumlah sel penghasil IFN-ɤ dengan jumlah sel pengekspresi CD 14, hasil statistika uji korelasi antara jumlah sel penghasil IFN-ɤ dengan jumlah sel pengekspresi CD14 menunjukkan hubungan ditemukan hasil yang bermakna (signifikan) adalah 0,005 (CD14) dan kurang signifikan pada nilai 0,054 (IFN-ɤ).Pada Uji Komparasi Ganda dengan Post Hoc Tests Games-Howell dari jumlah sel pengekspresi CD14 tabel 5.4 di atas, menunjukkan hasil yang bermakna /signifikan pada p<0,05 pada kelompok perlakuan bila pemberian EBD 200 mg/KgBB terhadap pemberian obat Metil Prednisolon. Serta pada jumlah sel Interferon Gamma, menunjukkan hasil yang bermakna / signifikan (p<0,05) pada kelompok perlakuan pemberian EBD 200 mg/KgBB terhadap pemberian obat Metil Prednisolon.Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan Aktivasi Makrofag yang dilihat dari peningkatan jumlah sel yang terekspresi CD 14 diikuti dengan peningkatan aktivitas atau jumlah sel IFN - ɤ. Peningkatan yang kurang bermakna dari IFN-ɤ dari penelitian ini kemungkinan dalam peran sel T CD 8+ yang berperan dalam mengsekresikan IFN-ɤ kurang teregulasi secara optimal serta bisa saja sel yang mengekspresikan IFN gamma terikat sebagian dalam pengecatan Imunohistokimia dengan metode pewarnaan Double Stain.Penelitian ini menyimpulkan Ekstrak Etanol Umbi Bawang Dayak (EEUBD) dosis 200 mg/kg BB mempengaruhi peningkatan jumlah sel yang mengekspresikan CD 14 pada mencit BALB/C . Peningkatan jumlah sel yang mengekspresikan CD 14 ini menunjukkan peningkatan aktivasi makrofag.Peningkatan ekspresi IFN gamma pada dosis 200 mg/kgBB pada perlakuan mencit BALB/C kontrol dengan CMC Na menunjukkan bahwa EEUBD kurang bermakna dalam penelitian ini karena dengan pengecatan Double Stain yang tidak tercat atau terikat baik seperti yang diharapkan sehingga bisa saja sel yang mengekspresikan IFN gamma terikat sebagian dalam pengecatan.Peningkatan jumlah sel yang mengekspresikan CD 14 dimana meningkatkan makrofag yang aktif ini menunjukkan bahwa peran EEUBD ini dalam respon imun , berperan dalammengeluarkan substansi penting termasuk enzim,lisozim dimana akan memusnahkan bakteri atau benda asing. Kata Kunci : ekstrak umbi bawang dayak , imunosupresi , aktivasi makrofag,sitokin IFN-ɤ , respon imun.